保存相关制备培养使用疑难基及解答

01 培养基的制备实验室制备

正确制备培养基是微生物检验的最基础步骤之一。使用脱水培养基和其他成分，使用尤其是保存含有有毒物质(如胆盐或其他选择剂)的成分时,应良好遵守实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的培养不正确制备会导致培养基出现质量问题。

使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，基及解答应严格按照厂商提供的相关使用说明配置。记录所有相关数据，疑难如质量/体积、制备pH、使用制备日期、保存灭菌条件和制备人员等。培养

使用个别成分制备培养基时,基及解答应按照配方准确配制,记录所有细节信息,如培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、相关制造商、疑难批号、制备pH、培养基体积(分装体积)、无菌措施(包括实施的方式、温度及时间)、配置日期、人员等,以便溯源。

1.水

除特定要求,实验室用水的电导率在25℃下应不高于25uS/cm(相当于电阻率≥0.4MΩcm)。

微生物污染应不超过103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。应根据GB/T 5750.12或其他有效方法,定期检验微生物的污染。

2.称量和复水

称量所需量的脱水培养基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物质的培养基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培养基结块)后再加水至所需的量。

3.溶解和分装

脱水培养基加水后适当加热,并不搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热溶解前应浸泡几分钟。

4.pH的测定和调整

用pH计测定pH,必要时在灭菌前调节pH，除特殊说明外,培养基灭菌后冷却至25℃时,要求pH的变化不超过0.2pH单位.通常使用浓度约为40g/L( 约1 mol/ L)的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L)的盐酸溶液调节pH。如果灭菌后调节pH，溶液需灭菌。

注:商品化培养基在高压灭菌前后pH可能发生明显变化,但使用蒸馏水或去离子水时,灭菌前无需调节pH。

5.分装

将配置好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积至少为体积的1.2倍。

6.灭菌

①概述

培养基和试剂的灭菌通常采用湿热灭菌或过滤灭菌。

有些培养基无需高压灭菌,可煮灭菌。如含亮绿的肠道菌培养基对光和热特别敏感，应在煮沸后快速冷却，避光保存。同样，一些试剂则不需要灭菌，直接使用(参见相关标准或生产厂商的使用说明）。

②湿热灭菌

湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行。高压霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培养基的体积超过1000mL，要对灭菌条件进行适当的调整。所有操作均要按照标准和使用说明的规定进行。
注：大容量培养基（＞1000mL）灭菌时可能会造成过度加热。

加热后应采取适当的方式冷却，防止沸溢。这对大容量培养基和敏感性培养基（如含亮绿的培养基）是非常重要的。

③过滤灭菌

过滤灭菌可以在真空负压或正压条件下进行。使用无菌设备和0.2um孔径的滤膜。将过滤装置的各个部分消毒灭菌,或使用预消毒设备。
一些滤膜上附着蛋白质或其他物质(如抗生素)。为达到有效过滤,应事先将滤膜用无菌水润湿。

④监测

应对经湿热或过滤灭菌的培养基进行监测,尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测。

7.添加剂的制备

制备含有有毒物质(特别是抗生素）时应小心操作，避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应。采用适当的预防措施并小心按照产品使用说明操作。不要使用过期的试剂；抗生素工作溶液现配现用；批量配置的抗生素溶液分装后向冷冻保存，但解冻后的贮存溶液不可再次冷冻;厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的相关资料，也可由使用者自行测定。

02 培养基的使用

1.琼脂培养基的融化

将培养基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高压锅中的蒸汽)融化。经过高压灭菌的培养基尽量减少重新加热的时间,避免过度加热。培养基融化后立即移开,室温静置片刻(约2min），以免玻璃容器发生破裂。

融化后的培养基放入47℃~50℃恒温水浴锅中保温，冷却到47℃~50℃所需的时间取决于培养基的类型、体积和在水锅里的分装量。融化后内培养基应尽快使用，放置时间一般不超过4h。剩余的培养基固化后不得再次融化使用。特别是灵敏性培养基，应根据相关标准，缩短融化后放置的时间。

将琼脂培养基倒入类似检测培养使用的独立容器中,插入温度计,记录并保存琼脂的融化温度。

加入样品的培养基应将温度调节到44℃~47℃，或按照相关标准调节温度。

2.培养基的脱气

必要时，在使用前将养基放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min,加热时松开容器盖子；加热后盖紧盖子，并迅速冷却至使用温度。

3.添加成分的加入

对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃~50℃时加入,灭菌的添加成分加入前应冷却至室温,避免冷的液体会造成琼脂凝胶或形成片状物。将添加成分慢加入培养基并充分混匀，尽快分装到待用的容器中。

4.培养基的弃置

所有污染和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式,并符合相关法律法规的规定。

03 平板的制备和储存

傾注融化后的培养基到平皿中,使之在平皿中形成一个至少3mm厚度的琼脂层(直经90mm的平皿通常要加入18mL-20mL琼脂培养基),或根据相关标准要求制备平皿。将平皿盖好皿盖后放置在水平平面使其冷却凝固。如果平板要储存、培养时间超过48h或培养温度超过40℃，要增加培养基的倾注量。

注：在培养过程中,琼脂培养基会损失水分,在某些环境条件下会影响微生物的生长,造成培养基水分损失的因素很多,如培养基的成分、平皿中培养基的量、培养箱的类型(如使用带风扇的培养箱)、培养箱里的空气湿度、平皿在培养箱中放置的位置和数量以及培养温度等。

凝固后的培养基应立即使用或存放在防止其成分发生变化的条件下,如存放于暗处和(或)5℃±3℃冰箱的密封袋中。在平板的底部或侧面做好标记,标记的内容包括培养基名称、制备日期和(或)有效期,也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。

将倾注好的平板放在密封袋中冷蔵可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生,平板应冷却后再装入密封袋中。贮存前不要对培养基表面进行干燥处理。

对于采用表面接种的固体培养基,应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖,将平板倒扣于烘箱/培养箱中(温度设置为25℃~50℃)；或放在有对流风的无菌净化台中,直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商业化的平板脂培养基应按照厂商提供的说明使用。

04 疑难解答

1.培养基不能凝固                                              

①培养基制备过程中过度加热

②低pH值造成培养基酸解

③琼脂使用量不正确                                           

④琼脂未完全溶解                                             

⑤培养基成分未充分混匀                                                                                                 

2.pH值不正确                                                   

①培养基制备过程中过度加热

②水质不佳                                                 

③外部化学物质污染

④在不正确温度下测量pH值

⑤pH计未正确校准                                           

⑥脱水培养基质量差     

3.颜色异常                                                        

①培养基制备过程中过度加热

②水质不佳                                               

③脱水培养基质量差                                          

④pH值不正确                                                   

⑤外来污染                                                                                                              

4.产生沉淀                                                      

①培养基制备过程中过度加热

②水质不佳                                                 

③脱水培养基质量差

④pH值未正确控制

⑤如果是各别成分制备的培养基---原材料不纯   

5.培养基出现抑制/生长率低

①培养基制备过程中过度加热

②水质不佳                                                

③脱水培养基质量差                                         

④配方使用不对                                                   

⑤添加成分不正确，如加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误       

⑥添加物被污染                                                                                

6.污染                                                     

①灭菌不充分                                               

②无菌操作有误                                                   

③添加物被污染            
 

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